HTML

DNS a fazékban

A blog célja kettős: egyrészt magamnak tárolok feljegyzéseket, másrészt ha valakit érdekel, bepillantást nyerhet a kutatásba, a kutatók hétköznapjaiba.

Friss topikok

  • VasMacska: Köszönöm - a többi olvasó nevében is - az információt! Igen, a Google "Scholar" elég sok mindent i... (2012.01.05. 00:11) Adatbázisokról
  • VasMacska: @pottyosgaloca: Örülök, ha segítettem. Azt azért fontos látni, hogy az itt leírtak koránt sem hely... (2011.11.26. 23:53) Immuncitokémia, western blot és társaik
  • VasMacska: @karvajfog: Köszönöm, jogos, javítva... Ilyen, amikor az magyaráz, akinek fogalma sincs róla... :-... (2011.05.04. 23:18) Sejttenyésztés
  • VasMacska: Köszi a novellát, érdekes. Nem gondolnám, hogy kiléptünk az evolúcióból, sőt! A technológiai vívm... (2011.04.07. 20:28) Egy elméletről - szigorúan szubjektíven

Linkblog

Pechek és trükkök

VasMacska 2011.08.11. 19:13

   Ígéretemhez híven most olyan apróságokról írok, amelyek meglehetősen fontosak, de a könyvekben, folyóiratokban általában nem szerepelnek. Megosztok néhány praktikát (részben saját tapasztalat), amit a laborban dolgozó olvasók (van-e ilyen egyáltalán? :-)) esetleg hasznosíthatnak. Így nem kell mindent a saját kárunkon megtanulni.

   Egy egy cikket elolvasva, annak metodikája, kivitelezése viszonylag egyszerűnek tűnik. Aki azonban már eljutott egyszer a kísérletek tervezésétől a cikk megírásáig, tudhatja, hogy még a legegyszerűbb ábra (akár mellékletben) mögött is több heti kemény és kínkeserves munka állhat. Persze ez nincs mindig így. Ha egy adott területen (és főként metodikára gondolok) valaki már jártasságot szerzett, akkor felkészülten várja az esetleges buktatókat.

   Egy teszt, vagy ahogy ma divatosabb, "assay" vásárlásakor a gyártó általában mellékel egy protokollt is, azaz egy papírt, hogy hogyan használjuk a cuccot. Általában megadja, hogy milyen körülmények közt tesztelték, és általában nem vállalják a felelősséget azért, ha mi másként akarjuk használni. Például egy antitestet teszteltek, ami a PamPamPam fehérjét mutatja ki mondjuk immunhisztokémiával paraffinmetszeteken. A tesztet egér vékonybélen végezték. Én meg egér izomszövetet vizsgálok. Feltehetően így is fog működni, sőt elvileg bármilyen egér szövetből készült paraffinmetszeten.

   Lehet, hogy én fagyasztásos technikával készített egér metszeteken akarom nézni. Vagy jó lesz, vagy nem. Lehet, hogy ELISA technikával szeretnék mennyiségi meghatározást végezni. Itt már kisebb az esélye a sikernek, de nem kizárt. Immuncitokémiára feltehetően jó, bár nem írták (immunhisztokémiát szöveten, citokémiát tenyésztett sejten végzünk). Szóval megvehetjük, aztán lehet próbálkozni, vagy kereshetünk olyat, ami pontosan a mi céljainknak megfelelő (és létezik is olyan). Antitestek esetében minden esetben fontos ismerni, hogy az általunk vizsgált fajhoz készült-e az antitest (ha már antitesteknél tartunk). Pl. egér ellen anti-egér, anti-nyúllal nem fog menni. Előfordul, hogy egy-egy antitest több fajon is működik; ezt a gyártó jelezni szokta (pl. egér, ember, patkány egyaránt). Ennek oka, hogy az antitest a vizsgált/keresett fehérjén olyan epitópot (molekuláris mintázatot) ismer fel, amely több fajban is azonos.

Na, de ez nem tanóra, nézzünk néhány vicces törvényszerűséget, illetve néhány hasznos tanácsot. A legelső legyen egy nagyon régi Murphy-törvény (hátha valaki még nem ismeri): "A forró üveg pontosan úgy néz ki, mint a hideg." Hát, igen...

   Legyen a következő a "méretre levágott kábel mindig rövidnek bizonyul". Ez így ültetném át a laborba: a pontosan kimért oldat mindig kevesebbnek bizonyul. Bosszantó lehet ez akkor, ha nagyszámú mintával és kis térfogatban dolgozunk, igen híg oldattal.

   A gumikesztyűs dobozban általában páratlan számú kesztyű van...

   Ja, még egy Murphy törvény, ez is gyakran "bejön": az a pillanat, amikor végre hátradőlsz egy picit, és fújsz egyet, egybeesik azzal a pillanattal, amikor a főnököd bekukkant az irodába.

   Ahogy a vajas kenyér a vajas oldalára esik, úgy a tárgylemez a mintával lefelé esik (és sérül a minta...).

   Gyakorlatiasabb dolgok: fedőlemezen sejtet tenyészteni, majd immunhívást végezni veszélyes; pár kör után, vagy fedéskor nehéz eldönteni, hogy melyik oldalán vannak a sejtek. Jobb ilyenkor a lemezt fedésig nem mozgatni (a vizsgálat lépéseit pl. plate-en végezni), és fedéskor előbb rácsöppenteni a fedőmédiumot, így látjuk, melyik oldala kerül majd lefelé.

   Fedtem már le fordítva megfestett metszetet is, majd reggel csodálkoztam, hogy miért száradt ki.

   Az aceton oldja a műanyag plate-eket, Petri csészéket, fixálásra ilyenkor metanolt használjunk. (Ezt is saját káromon tanultam meg...)

   Tárgylemezen fluoreszcens immunkémia esetében sokan használnak zsírtollat, ám ez a jó fedést megnehezíti. Ilyenkor fedés előtt xiloba (v. xilol helyettesítőbe) mártott fülpiszkálóval a zsírtoll leszedhető. Overnight inkubálás alatt (pl. primer antitesttel) a mintára fedőlemezt v. parafilmet tehetünk (szerintem a parafilm jobb, könnyebben lejön).

Szárazjégre ne öntsünk vizet (pláne ne mosogatószerest)!

Üvegedény (ha nem hőálló) a kuktában eltörik.

Kiömlött acetonban oldódó anyagot ne mossunk fel műanyag (PVC) padlóról acetonnal, mert a padló is jön vele. Más megoldást viszont nem ismerek... :-)

Az egér harap. :-)

Legegyszerűbb nedves kamra: asztalra pár réteg szűrőpapír, rá deszt. víz, és egy tálcával lefedjük.

Akinek van bátorsága, letesztelhet, hogy mennyi "egyensúly-hiányt" tűr el a centrifuga. Némelyik elég sokat, de csak óvatosan!

Viszkózus anyaghoz reverz pipettázás: benyomni tövig, lassan teljesen felengedni, majd első ütközésig üríteni. Jó megoldás lehet a pipetta hegyének levágása (pár milliméter) is.

Nagyon illékony anyagok pipettázáskor is csepegnek, a hegy erőteljesebb felhúzásával ez csökkenthető.

Tárgylemez-törés ellen mikroszkópiánál: az objektívet oldalról nézve (tehát nem az okulárba nézünk) csaknem a fedőlemezig engedjük, és innen távolítjuk már az okuláron át vizsgálva. Érdemes a vizsgálatokat mindig a legkisebb objektívvel kezdeni. Jó minőségű és összehangolt objektívek esetén az objektív váltásakor a fókuszsíkban maradunk, csak a fényerőt/kondenzort kell állítani. (A kondenzor azért van, hogy használjuk!)

Sosem írunk olyan cső kupakjára, ami teljesen leszedhető. És pláne nem nyitunk ki egyszerre többet (különben jön a "most melyik volt melyik" probléma).

Kifelé fújó fülkében nem érdemes veszélyes anyaggal dolgozni, az minket nem, csak a mintát védi.

A hosszú ideje jól működő rendszer bármikor bekrepálhat. Ugyanilyen érthetetlen módon ismét meg is javulhat. Ha valami, vagy több minden egy ideje nem megy, a legjobb szabira menni, vagy mást csinálni, aztán majd sikerülni fog.

   Ilyenek vagyunk mi. Kirántjuk a DNS-t, látjuk az immunt, inkubálunk, futtatjuk a gélt, aztán beágyazunk, teljesen csöndben hívunk, fülke alatt vagyunk, mindent csőben tartunk, és meghúzzuk az egeret.

   Egyelőre ennyi jutott az eszembe, de még biztosan sok minden van. Majd leírom.

 

 

Címkék: antitest tudományos folyóirat sejtkultura immuncitokémia western blot

Szólj hozzá!

A bejegyzés trackback címe:

https://dnsafazekban.blog.hu/api/trackback/id/tr853146688

Kommentek:

A hozzászólások a vonatkozó jogszabályok  értelmében felhasználói tartalomnak minősülnek, értük a szolgáltatás technikai  üzemeltetője semmilyen felelősséget nem vállal, azokat nem ellenőrzi. Kifogás esetén forduljon a blog szerkesztőjéhez. Részletek a  Felhasználási feltételekben és az adatvédelmi tájékoztatóban.

Nincsenek hozzászólások.
süti beállítások módosítása