Ezek korábban már említett, de még nem tisztázott fogalmak. Így most adok egy kis áttekintést ezekről.
Lelkük az antitest. Az antitest egy olyan fehérje, ami egy molekulát képes felismerni és ahhoz hozzá kötődni. Eredendően a B-limfociták, pontosabban az azokból differenciálódó plazmasejtek termelik. Ezek a sejtek az immunrendszerhez tartoznak. Feladatuk, hogy olyan fehérjéket termeljenek, melyek képesek egy a test számára nem kívánatos anyag felismerésére és megjelölésére. Keletkezésük nem minden részletében ismert. Ugye rengeteg "nem kívánatos" anyag létezhet, az ezeket felismerő fehérjék száma szinte végtelen. Ezek nem lehetnek mind a DNS-en kódolva, így keletkezésük úgymond a véletlenre van bízva. A sejtek tehát véletlenszerűen termelik az antitestet, egy-egy sejt egyfélét (a keletkezésük tehát klonális). Ha a termelt antitestnek van értelme (azaz felismer idegen struktúrát), a sejt nyert. Ha nem, vagy saját anyagot ismer fel, a sejtnek pusztulnia kell, ezt ún. programozott sejthalállal teszi (apoptosis). Ha mégis életben marad a sejt, és termeli azt az antitestet, ami saját struktúrát ismer fel, a test önmaga ellen dolgozik (ún. autoimmun betegségek). Az így keletkezett antitest csak megjelöli a testidegen anyagot, a pusztítást erre specializálódott sejtek végzik. Az antitest tehát csak a jel, hogy mit kell elpusztítani.
Hogyan is tudjuk ezt használni? Lássunk egy példát!
Az emberi aktint akarom vizsgálni. Ez egy fehérje, ami a sejtek belső vázát képezi, a mozgások kivitelezésében van szerepe. Tisztítok magamból egy kis aktint (egy vérvétel elég lehet). Fogok egy nyulat. Na nem a mezőn, hanem egy kísérleti állatházban. Beoltom neki az aktinomat. Ez egy szuri. A nyúl immunrendszere számára az én aktinom testidegen, azaz megsemmisítendő. Kiszelektálódnak benne tehát olyan sejtek, amelyek anti-humán aktin antitesteket termelnek. Nincs más dolgom, mint egy idő után leszívni valamennyit a nyuszi véréből, a sejteket centrifugálással leülepíteni, és a fennmaradó vérszérumban ott lesz az anti-humán aktin. Ha ezt egy emberi szövetmintára öntöm, ezek az antitestek felismerik az aktint és hozzá kötődnek.
Az így nyert szérum (vagy savónak is hívják; sokan még a mai modern antitest-oldatokat is) poliklonális antitesteket tartalmaz, mivel a nyúl több plazmasejtje is termelhetett anti-aktint, ezek az aktin más-más részét ismerik fel. Ha kiválasztom azt az egy sejtet, ami a számomra legmegfelelőbb antitestet termeli, és ebből sikerül tenyészetet csinálnom, a termelt antitestem monoklonális lesz, mivel egyetlen sejt tökéletesen azonos termékei.
De hát ilyeneket már nem csinálunk a 21. században! Nem bizony. Egyrészt nem fabrikálunk házilag antitestet (kivéve persze speciális eseteket), hanem készen vesszük. Olyan gyárakból, ahol ezt iparilag végzik. Rengeteg sejttenyészettel, immortalizált (halhatatlanná tett) sejtekkel, az antitestet pedig tisztítják. 100 mikroliter (milliliter tizede, olyan "két csepp") 60.000-200.000 Ft. Persze ez a mennyiség rengeteg kísérletre elég. Nézzünk egy példát erre is! Ez egy nyúl által termelt poliklonális anti-aktin antitest, sok módszernél használható, több fajon működik. Az immunizálást (antitest-termelés kikényszerítését) szintetikus peptiddel végezték (még vért sem kellett venni, hála a fehérje-mérnökségnek!). Képeket is mellékeltek.
Mire használhatjuk? Elvileg bármire. A gyártó meg szokta adni, hogy milyen módszerekkel próbálták ki, de néha ennél többre is jók. (Néha meg még arra sem...) Ezzel kísérletezni kell, kollégákat kikérdezni, szakirodalmat átnézni (ki használta, mire, hogyan, milyen eredménnyel?).
Hogy használjuk? Van olyan antitest, amit megjelölnek egy olyan molekulával, ami fény hatására világít (fluoreszcens molekula, fluorokróm, fluorofór, parasztosan festék). Ekkor kb. annyi a dolgunk, hogy a cuccot (jól felhígítva) a vizsgálati anyagra öntjük. Általában flow cytometriára használják (a sejtek egy lézersugár előtt úsznak el egyesével, a lézerfénnyel elemzik a sejt méretét, alakját, és hogy világít-e, azaz kötődött-e hozzá antitest).
Az így kapott jel sokszor gyenge, a jelet erősíteni kell. Erre szolgálhat egy másik antitest, ami az elsőt ismeri fel, és kötődik hozzá. Ha az elsődleges antitesthez kötődik két másik másodlagos (példánkban a nyúl anti-humán aktinhoz egy ló anti-nyúl, ami kék fényre zölden világít), a jelet máris dupláztuk. Ha egy másodlagos antitesthez 2 fluorokróm van kötve, négyszereztük.
A lényeg gyakorlatilag ennyi, a továbbiakat csak "apróbetűsként" írom, elolvasását csak nagyon érdeklődőknek és fakíroknak ajánlom.
A másodlagos antitesthez enzimet is lehet kötni. Gyakran kötnek hozzá tormaperoxidázt. Ehhez az enzimhez megfelelő szubsztrátot (azaz az enzim számára felhasználandó anyagot) adva színes, oldhatatlan csapadék keletkezik. Így az elsődleges antitestet - meglehetősen közvetett módon ugyan - ismét láthatóvá tettük. A módszer hátránya, hogy macerásabb (bár ma már nem is), de nem kell speciális mikroszkópokkal világítgatni, és minőségét csaknem korlátlan ideig megőrzi (a fluoreszcens jelölés idővel tönkremegy, pláne ha mondjuk kitesszük a napra). Így látjuk, hogy a keresett anyag jelen van-e a sejtekben, ha igen, akkor hol, és a fluoreszcencia intenzitásból következtetni lehet a mennyiségére. Szofisztikáltabb módszerekkel élő sejteben az anyagok mozgása is megfigyelhető, lehet mérni különböző fehérjék távolságát is (és még sok mindent).
A western blot lényege, hogy a fehérjét kitisztítjuk a sejtből (mindet), a fehérjéket tömeg szerint szétoszlatjuk egy gélben elektromos áram segítségével, majd a fehérjéket egy fóliára visszük át, és itt végezzük a jelölést az antitesttel. A másodlagos antitesten szintén tormaperoxidáz van, de most olyan reakciót végeztetünk vele, ahol fény keletkezik. A fény pedig fotópapíron nyomot hagy, így gyakorlatilag le tudjuk "fényképezni" a fehérjéket. Mennyiség meghatározására pontosabb a hagyományos immuncitokémiánál (szöveten hisztokémia), de nem ad információt arról, hogy az anyag hol volt a sejtben (ha előtte a sejt egyes alkotóit szeparáljuk, és azután tisztítjuk a fehérjéket, ilyen információk is szerezhetők).
ELISA reakció esetében (enzyme-linked immunosorbent assay) a vizsgálatot egy kis térfogatú edényben végezzük, az enzim által létrehozott reakciótermék színintenzitásából következtetünk mennyiségre; talán a legpontosabb módszer, de csak oldatokkal működik.
Radioaktív jelölés is lehetséges (radioimmunoassay), így akár PET vizsgálatok is kivitelezhetőek (PET-tel élőlényekről kaphatunk 3D képeket, kimutatja, hogy hol van a testben az antitest; ma még nem elterjedt módszer). Természetesen ezeket kombinálni is lehet. Sok cég fejleszt mindenféle hasonló dolgokat, az alapelv ugyanez: az antitest specifikus kötődése. Másik cél, a kutatóból pénzt kihúzni a gyorsan és könnyen elérhető fantasztikus eredmény reményében. A diagnosztikában természetesen előny a gyorsaság. Mostanság a kutatásban is, hiszen verseny van. Állítólag a jó munkához idő kell. Én egy immuncitokémiát 2 napig csinálok, de meg lehet csinálni egy délelőtt alatt is (adott esetben pár óra). A "lassabb" módszer általában szebb eredményt ad. A módszer(ek) nagyon egyszerűnek tűnnek. De ezeket beállítani, optimalizálni, megtalálni a legjobb kivitelezési körülményeket, az sok idő. És nem is mindig sikerül.
Viszonylag új módszer például az a megoldás, ahol az antitestek egy "lapra" vannak kötve, erre ráöntjük a vizsgálni kívánt anyagot, elvégezzük a jelölést, és a pozitivitást foltok jelölik. Ennek a módszernek előnye, hogy egy vizsgálati anyagból (ez itt csak folyadék lehet) egy menetben akár 5, 10, 30, akárhány mérés elvégezhető.
Ennek a fordítottja, mikor több mintát "pakolunk egybe", és egy menetben egy antitesttel egyszerre 10-20-30 mintán végezzük el a reakciót. Itt természetesen nagyon fontos a reprezentatív mintavétel. Egy adott szövetből egy 2 négyzetcentiméter felületű metszeten jobban megítélhető az eredmény, mint egy 4 mm átmérőjű szövethenger metszetén. Megint: az idő pénz? Jó munkához idő kell? Legyünk maradiak, és bízzunk a jól bevált módszerekben, vagy haladjunk a korral, és dolgozzunk fel óriási mennyiségű mintát pillanatok alatt?
Azt gondolom, a diagnosztikában igen/nem döntéseket kell hozni, azaz a keresett dolog vagy ott van, vagy nincs. A kutatót az is érdekli, hogy pontosan hol van, mennyi van. A kutató az eredményeit tudományos folyóiratokban közli. Fotót mellékel az eredményről. Nem tudom, ki hogy van ezzel, de szerintem fontos, hogy az ember igényes fotókat közöljön. A folyóirathoz beküldött anyag bírálói is biztosan jobban örülnek egy szép képnek, mint egy maszatos szakadt metszetnek, ami foltos, és épphogy kivehető rajta a jel. Vagy épp nem támasztja alá a fotó a mellékelt szöveget (sajnos sok ilyen van...). Hát én is hogy bízzak meg abban az adatban, amihez a mellékelt képen nem látom, hogy amit látni kellene, az valóban ott van?
Kitek: a kedvenceim. Ezeket szintén cégek gyártják (mekkora megállapítás!!), céljuk, hogy adott összegért vegyél meg egy doboznyi reakciókelléket, csináld meg azt, ami a mellékelt papíron van, és kész a pompás eredmény pikk-pakk. Igen, ezek sokszor jók. Különösen ott lehet áldásos, ahol az adott vizsgálatot nem végzik, de néhány vizsgálatot mégis el kell végezni. Nem kell venni egy liter festékoldatot (pláne nem kell összeállítani), hanem mellékelnek 10 cseppet, ami 50 vizsgálatra elég. Nem kell érteni hozzá, nem kell tapasztalat, rutin, semmi. Öntsd "A"-t "B"-be,öntsd a mintára, várj 5 percet, mosd le vízzel, add hozzá a "C"-t 10 perc, mosd le és kész. A kísérleti patkány is meg tudná csinálni, ha nagyobb lenne a keze. Nem, nem szeretem őket. A gyártó gondosan ügyel arra, hogy ne tudd meg, miből készült. A gyártó tesztelési körülményei közt biztosan pompásan működött. De máshol nem feltétlenül működik. És ha nem megy, nem lehet tudni, hogy hol kellene belenyúlni.
Olyan ez mint az instant kakaópor. Vagy veszel kakaót (amilyet szeretsz), cukrot (amilyet akarsz), összekevered (olyan arányban amit szeretsz), felöntöd tejjel. Vagy fogod az instant kakaóport, ráöntöd a tejet, "oszt" lesz amilyen lesz. (Ha van cukor meg kakaó, akkor utólag korrigálható, sajnos csak a kakaó...) Sosem tudni előre, hogy amit megveszünk, az milyen lesz. Hogy a mi laborunkban hogy fog működni. Érdemes beszélni olyanokkal, akik már használták. Van persze olyan kit, amitől már én sem tudok elszakadni. Mert egy jó ötletet kihasználva tényleg nagyon gyorsan, tényleg nagyon jó eredményeket produkál. Ezeket persze meg is kell fizetni. Van ami gagyi, vagy pedig már pont fényűzés.
A sejttenyésztéssel foglalkozó bejegyzésben írtam a sejtszámolásról (Bürker-kamra, tripánkék festék). Erről valószínűleg sosem fognak leszoktatni. Baromiolcsó, baromigyors, baromipontos és nem kell hozzá áram. Egyszer "megvertem" egy sejtszámológépet.
Egy pénzes intézetben volt szerencsém dolgozni, egy kollégával épp a sejttenyészet indítását ismertettem. Mikor kinyerjük a sejteket, meg kell számolni, hogy mennyi van, az alapján tesszük ki őket a tenyészedényekbe a megfelelő mennyiségű tápközeggel. Hát volt sejtszámológép, hozzá sejtszámoló kit. Egy speciális tárgylemez ment bele, meg valami jó fantázianevű kék festék, ez mellékelve van a kitben (teszem azt 100 sejtszámolásra). Gyanítom, hogy tripánkék az is, csak 2x-5x áron. A lényeg, hogy én is kíváncsi voltam rá, csak be kellett pipettázni egy kicsit a sejtszuszpenzióból (sejtek a médiumban), és már köpte is ki, hogy 15 millió. (Aha, persze, gondoltam...)
Igen, itt jön ki a probléma (vagy csak én domborítom ki). A kolléga még csak akkor ismerkedett a sejtkultúrák indításával, tehát simán elhitte. Ez nem is baj. Én viszont tudtam, hogy a kiindulási szövetből csaknem lehetetlen, hogy ennyi sejt legyen. Végül kitettünk valamennyit egy tenyészedénybe, és mikroszkóp alatt láttuk, hogy tényleg nincs annyi, jó ha 3 millió van. Ha nem oszlatjuk szét egyenletesen a sejteket a médiumban, és kiszippantunk egy nagyobb sejtcsomót, a gép kiadja, hogy az egész mintában rengeteg a sejt (pláne ha koszokat, egyéb törmelékeket is beleszámol, mert a gép nem tudja, hogy mit kell nézni). Ha kézileg csináljuk, a Bürker kamrában mikroszkóppal látszik, hogy a sejtek eloszlása nem egyenletes. Ilyenkor "felkavarjuk" a löttyöt, és újra mintát veszünk. Ezt a gép nem tudja. A gép 30 másodperc alatt számol, és nem tudja, hogy tévedett. Én 45 másodperc alatt számolok, látom ha tévedek (legalábbis többször mint a gép), és meg is néztem a sejteket.
Hát, mit mondjak. Mindig mindent alaposan meg kell vizsgálni, utána kell érdeklődni, ki kell próbálni. Ha jó, használjuk, mert jó. Ha nem jó, ne erőltessük.
Vizuálisoknak:
az elvet bemutató videot csak ELISA-ról találtam:
Immunhisztokémia (unalmas):
western blot:
