Az írásokban említett módszerek bemutatása elkezdődik. Elsőként talán az általam (és sokak mások által is) leggyakrabban használt módszerről írnék, ez a sejttenyésztés.
Mikor valamit vizsgálunk, a legjobb lenne mindent embereken tesztelni. Mivel a tesztek kimenetele általában bizonytalan, vagy gyakran arra vagyunk kíváncsiak, hogy egy károsító hatás hogyan működik, azt nyilván nem célszerű így vizsgálni (bár voltak nem szívbajos "kutatók" pl. a II. világháborúban...). A teszteket elsőként sejttenyészeteken szokás kezdeni. Ezek viszonylag olcsón előállítható vagy megvásárolható objektumok. Egyben modellek is. Azaz várhatóan úgy viselkednek, vagy legalábbis hasonlóan, mint azt a testünkben is teszik. Nyilván nem teljesen ugyanúgy, egy műanyag edényben növő sejtek nem viselkednek úgy, mint az emberi test. Ezekben a rendszerekben a sejtek lehetőleg semmilyen hatásnak nincsenek kitéve, pontosan tudjuk szabályozni, hogy mi történjen, és mi ne. Ettől lesz a kísérleti rendszerünk "tökéletes", zavaró hatásoktól mentes. Ez egyben a hátránya is; egy sejttenyészet, és a testben élő sejtek, melyek szöveti kötelékben vannak, "elégedettségük" a test használójától függ, ezek a sejtek kommunikálnak más sejtekkel, esetleg távolabbi szervekkel, és az ideg-és hormonrendszer irányítása alatt állnak. A sejteken megfigyelt jelenségek tehát nem vehetők készpénznek. Ezért a kísérletek általában a következő szinteken zajlanak: sejttenyészeten, kísérleti állatokon, emberen.
Itt tennék egy kellemetlen megjegyzést a "sötétzöldeknek": fejlesszünk egy gyógyszert! A sötétzöldek ugye folyamatosan tiltakoznak az állatkísérletek ellen. A kutató elvégzi a teszteket sejttenyészeten, az jön ki, hogy az anyag csodálatosan hat. Mehet a gyógyszertárba? A fentebb leírtaknak megfelelően a sejttenyészet esetében eldől, hogy a tesztelt gyógyszer-hatóanyag beválik (pl. gátolta a daganat-sejttenyészet növekedését, vagy nem hatott, vagy brutálisan pusztított, még egészséges sejteket is). Ezt állatkísérletek követik. Természetesen nem úgy, hogy fogunk egy elefántot az utcáról, beadjuk neki a cuccot, és nézzük, mi történik. Állatházakban tenyésztett kísérleti állatokon végezzük a vizsgálatokat. Az állatok kifejezetten erre a célra vannak tartva, esetleg a kísérletnek megfelelően előkészítve (igen szigorú szabályozás mellett). És itt kiderülhet, hogy mondjuk a tesztelt anyag valóban védi pl. a tüdőt a baciktól, de mellette igencsak nyírja a májat, vagy magas vérnyomást okoz. És ez a sejttenyészeten nem derült ki. Tehát, kedves Zöld, te bevennéd azt a gyógyszert, amit állatokon nem teszteltek? Ha már itt tartunk, írnom kell majd az állatkísérletekről is, de térjünk vissza a sejtekhez.
Mire van szükségünk? Sejtekre, ezeket szerezhetjük magunk, vagy meg is vásárolhatjuk. A sejtek számára biztosítani kell azokat (legalábbis merőben hasonló) a körülményeket, melyek közt "természetes élőhelyükön", azaz a test valamely szervében élnek. Erre megfelelően összeállított oldatot alkalmazunk. Az oldat tartalmaz a sejtek számára szükséges tápanyagokat is. Ezt az oldatot nevezzük médiumnak. Tartalmaz puffert, mely az oldat pH-ját képes bizonyos határok közt fixen tartani, esetleg a pH-t mutató indikátor-festéket, kaját (praktikusan cukor), aminosavakat (fehérjék építőkövei), és ún. növekedési faktorokat (olyan kis molekulák, melyek a sejtek életben maradásához, növekedéséhez szükségesek), esetleg a fertőződések elkerüléséhez antibiotikum-antimikotikum (baci és gomba ellen) keveréket. A sejteket inkubátorban tartjuk, mely megfelelő hőmérsékletet és páratartalmat biztosít. Nagyjából ennyi, a valóságban ez persze bonyolultabb.
Fontos, hogy mivel ezeket a médiumokat a bacik és gombák is szeretik, és a sejteket vírusok támadhatják meg, steril körülmények közt kell dolgoznunk. Ebben van segítségünkre a steril box. Ez egy olyan szekrény-szerűség, melynek a belsejét ki lehet fertőtleníteni, és csak egy ablakon lehet benyúlni. Az ablaknál egy "légfüggönyt" képez a gép. Ez egy gyorsan lefelé áramló "levegősáv', mint egy kb. 10-20 cm-es sávban erősen lefelé fújó szél. Így a boxba se be, sem abból ki nem juthatnak pici dolgok.
Tehát, megjött a sejt (kérhetünk egy kollégától is), bekapcsoljuk a boxot, kitakarítjuk, bemosakodunk, betesszük a sejteket, az előmelegített médiumot (ált. 37°C), és egy tenyésztőedényt. Ez lehet Petri-csésze, flaska, különböző tenyésztőlemezek, vagy egyéb spéci dolog. Minden steril. A sejteket összekeverjük a médiummal, az edényt lezárjuk, be az inkubátorba, kész. Ha a sejtek elfogyasztották a médium tápanyagtartalmát, lecseréljük a médiumot. Ha telenőtték a tenyészfelületet, új edényekbe osztjuk szét őket (ezt nevezzük passzálásnak).
Alapvetően kétféle sejttenyészet van: szuszpenziós, mely a médiumban úszkál mindenhol, ilyenek pl. a vér sejtjei; és adherens, vagy letapadó. Ezek a tenyésztőedény felületére tapadnak le. Ha nem tudnak letapadni, elpusztulnak. Ha egy rétegben telenőtték a felületet, a növekedésük megáll, elpusztulnak.
Úszkáló sejtek passzálása: a médiumot kipipettázzuk az edényből (benne a sejtekkel), centrifugálással a sejteket a cső aljára gyűjtjük, a régi médiumot eldobjuk, újat adunk hozzá (többet mint volt), és több edénybe pipettázzuk, ahol tovább nőhetnek. Letapadó sejtek esetén annyival bonyolódik a dolog, hogy a sejteket fel kell szedni az edény felületéről. Sokszor igaz biológiai kutatásoknál, hogy ha nincs késed, használj enzimet! Egy tripszin nevű fehérje-emésztő enzimmel el lehet vágni azokat a fehérjéket amikkel a sejtek kapaszkodnak a felülethez (a sejtek károsodása nélkül), és innentől kezdve a sejtek (bizonyos ideig) "úszkáló"-ként viselkednek, kipipettázzuk, centrifugálással összegyűjtjük, új médium, új edények, pár óra alatt ismét letapadnak és nőnek.
Nem is nagy dolog, ugye?
"Level 2", ha nem vásárolunk, és nem kunyerálunk sejtet, hanem magunk indítunk egy tenyészetet. Ez sem nagy ördöngősség, de picit több dolog kell hozzá. Kiindulási alapunk egy élőlényből eltávolított (szövet-) darabka, lehetőleg minél frissebb (még éljenek benne a sejtek). Ez lehet kihúzott szőrszál, műtéti hulladék, biopszia (pici mesterségesen eltávolított szövetminta), vér, meredekebb esetekben embrió, vagy ami éppen kell. Ebből - a szövet tulajdonságainak függvényében - ismét enzimek segítségével kiszabadítjuk a sejteket a szöveti kötelékből, elszakítjuk őket egymástól, majd médiummal tenyésztőedénybe pakoljuk, és várunk. Ha jól dolgoztunk, pár nap alatt a sejtek osztódni kezdenek, és örülhetünk a tenyészetünknek.
Az élettartamunk korlátozott, mert a sejtek élettartama korlátozott, ebből következően a sejteket nem lehet a végtelenségig szaporítani, a tenyészet idővel elöregszik majd elpusztul. Fiatal szervezet sejtjeiből jobb tenyészet indítható. Daganatosan transzformált sejtek ("ráksejtek") esetében más a helyzet velük pont az a gond, hogy a természetes elöregedésük nem történik meg, folyamatos osztódásra képesek, tenyészetben bármeddig fenntarthatók. A legismertebb ilyen sejt(vonal) talán a HeLa sejt, egy Henrietta Lacks nevű hölgy méhnyakrák sejtjeiből indították sok sok éve (1951), azóta szinte az egész világon mindenhol használják. Az ilyen daganatos sejtek kedvelt kísérleti objektumok. Sokan vizsgálják, jól karakterizálták (leírták, hogy milyen, hogy viselkedik, stb.), olcsón és gyorsan szaporítható, megvásárolható. Hátránya, hogy daganatos sejt, tehát nem feltétlenül úgy válaszol egy hatásra, ahogy egy "normális" sejt, de méhnyakrák tanulmányozására feltehetően kiváló. Azokat a sejttenyészeteket hívjuk sejtvonalnak, melyek bármeddig fenntarthatók. Ilyenek tehát a daganatsejtek, de laboratoriumi körülmények közt is elő lehet állítani ilyen sejteket.Ezek célja szintén az, hogy olcsón sok sejtet állíthassunk elő, melyek valamilyen szinten "szabványosak", így a világ különböző laboratoriumainak eredményei többé-kevésbé összehasonlíthatók.
A témához kapcsolódik még a sejtek fagyasztása. Ez akkor praktikus, ha a sejteket későbbre el akarjuk tenni (mert éppen sok van, és nem tudjuk felhasználni, vagy biztonsági tartalékra van szükség). A procedura folyamán a sejteket tenyésztőmédium, szérum (a vér folyékony, azaz nem sejtes része; általában marhaszérumot használunk) és DMSO (dimetil-szulfoxid) elegyébe tesszük, majd lassan lefagyasztjuk -70 v. -194°C-ra. A médium azért kell, mert a sejtek fagyasztva is élnek, táplálkoznak, de nagyon lassan; a szérum fontos anyagokat tartalmaz a sejtek számára, általában a tenyésztőmédium is tartalmaz szérumot, a DMSO pedig véd a fagyasztáskor képződő jégkristályoktól. A sejteket igen vékony kettős zsírrétegból álló hártya borítja (egy dupla zsírmolekulás réteg benne fehérjékkel), melyet a jégkristályok könnyen felszakítanak. Ezért kell lassan fagyasztani, így nem képződnek "durva" jégkristályok, a DMSO pedig a sejtek határolóhártyáját védi. A sejtek ezután folyékony nitrogénben hosszú ideig tárolhatók. A felolvasztás fordítva történik, nagyon gyorsan végezzük, majd a sejteket rögtön friss médiummal látjuk el.
Sejtszámolás: mivel a sejtek mennyiségének növelése rövidíti az időt, ami alatt kikajálják a tápanyagokat a médiumból, illetve azt az időt, ami alatt (a letapadó sejtek) a rendelkezésükre álló tenyészfelületet telenövik (és még sok más okból), nem árt tudni, hogy épp mennyi sejttel rendelkezünk. A munkát megkönnyíti, ha vannak már tapasztalataink e téren. Például tudjuk, hogy ha lerakunk 75 négyzet-cm felületre 75x 5000 db sejtet, akkor a flaskát 10 nap alatt növik tele. Ezért érdemes a sejteket rendszeresen számolni. Számolással megtudható az is, hogy egy hatás következtében a sejtek jobban szaporodtak, vagy pusztultak. Még jobb, ha a számolás során el tudjuk különíteni az élő és holt sejteket.
A számolás lényege, hogy a sejtszuszpenzióból (az az oldat, amiben a sejtek a lehető legegyenletesebben vannak eloszlatva) egy kis mintát veszünk, abban meghatározzuk a sejtszámot, és az így kapott értékből következtetünk a teljes mennyiségre.
A meghatározáshoz - a mikroszkóp mellett - egy segédeszközt használunk, ez a Bürker-kamra. Ez egy olyan speciális tárgylemez (tárgylemez az az üveglemez, amire a mikroszkóppal vizsgálandó dolgot tesszük, egy szimpla (v. nagyon spéci) üveglap), amibe egy négyzetháló, vagy négyzetháló-rendszer van karcolva. Különlegessége még, hogy ha fedőlemezt teszünk rá (fedőlemez az a nagyon vékony másik üveglap, amit a tárgylemezen levő vizsgálandó dologra teszünk; véd a kiszáradástól és mechanikai érüléstől), az 0,1 mm-re lesz a bekarcolt rácstól. Hogy egyszerűbb legyen, itt egy kép. Eddig a kezdő sejtszámolónak is világos szokott lenni. Itt kezdődik a kavarás, bonyolódás. Sok módszerrel lehet számolni, mindenki másra esküszik, szerintem a következő a legegyszerűbb:
Kiveszünk egy egység sejtet, összekeverjük egy egység 0,4%-os tripánkék festékkel (ez a festék az elpusztult sejteket sötétkékre festi, az élőket nem festi; pár perc múlva azonban azokat is, mert megdöglenek, mert a tripánkék mérgező), majd ebből a Bürker-kamra és fedőlemez közé pipettázunk annyit, hogy a folyadék szétfusson a két üveglemez között.
A klasszikus Bürker-kamrán több oldalhosszúságú négyzet is van (ld. kép), mindegy, melyiket használjuk a számolásra, de következetesen és átgondoltan kell csinálni. A helytelen számolás félrevezetőbb mint ha nem számolnánk.
Én a 0,2 mm oldalhosszúságú négyzetekből számolom össze (a fenti képen a közepes méretűek; a mikroszkópos képen a megvilágítás elég "ferde" lett...), hogy 25 ilyen négyzetben hány sejt van összesen. A 25-öt is úgy, hogy a két átlót, plusz egyet, ez 25. Így nem folyik ki a szemem, és ha a két átlóban összeadott sejtszám közel egyezik, az pedig utal arra, hogy a sejtek valóban egyenletesen el voltak oszlatva (ez is nagyon fontos; mivel mindjárt egy nagy számmal szorzunk, a kis hiba óriásira nő).
Akkor a matek része: egy ilyen 0,2 mm oldalhosszúságú négyzet területe 0,04 négyzet mm, mivel a fedőlemez 0,1 mm-rel van feljebb a rácstól, a térfogat 0,004 köb mm lesz. Ebből számoltunk 25 db-ot, összesen tehát azt néztük meg, hogy 0,1 köbmilliméter (azaz 0,1 mikroliter) folyadékban mennyi sejtünk van. Ha ezt szorozzuk 10.000-rel, megvan, hogy egy milliliterben mennyi a sejtünk. Végül az egészet szorozzuk kettővel, mert tripánkékkel az elején felére hígítottuk a mintát.
Egyszerűen tehát: 1:1 hígítás tripánkékkel, 25 0,2mm négyzetben a festetlen sejteket összeszámoljuk, eredménye "n". A sejtszám 1 mL-ben pedig: nx2x10000 db.
Összefoglalás helyett annyit, hogy ez mind szép és jó, de a sejtek sokszor nem kooperatívak. Ha sürget az idő, lassan nőnek, néha gyorsabban mint vártuk (általában a saját indítások viselkednek kiszámíthatatlanul), néha a legnagyobb körültekintés ellenére is befertőződnek, vagy elpusztulnak. Néha egy mérgező anyag hatására a növekedésük gyorsul (érdemes a méreg címkéjét megmutatni a sejteknek!). Persze olyan is van, hogy azt hiszi az ember, hogy hétfő reggelre tuti éhen halnak, ezért bemegyünk vasárnap este, és semmi bajuk (de csak mert bementünk). Ki kell őket ismerni, és szeretni kell őket. Jó móka ez! :-)
Végül elnézést kérek az "összelopkodott" képekért, igyekszem mihamarabb saját anyaggal demonstrálni az eszközöket.
Vizuálisoknak (sajnos használható demostrációkat csak angol nyelven találni):
Streil munka:
A sejtek passzálása (a hölgy köpenyének ujja belóg a steril boxba, ez elvileg szabálytalan, mivel annak tisztasága nem biztosítható; jobb rövid ujjú ingben dolgozni "bemosakodás" után), Bürker-kamra, sejtszámolás (letapadó és szuszpenziós sejtekkel):
